太阳集团城网站2003·(中国)官方网站

技术文章 / article 您的位置:网站首页 > 技术文章 > 士锋科技如何进行酶标记抗体制备
产品分类

Product category

士锋科技如何进行酶标记抗体制备

发布时间: 2013-07-19  点击次数: 1429次

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。酶标记物中zui常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

(一) 酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求:(1)来源方便,易于纯化;(2)比活性高,性质稳定;(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以zui常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3~9,酶催化的zui适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白zui大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(zui高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:

                        HRP

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。S(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称ABTS
 




XML 地图